Što je lančana reakcija polimeraze (PCR)? činjenice na testiranju, koraci i za koje se koriste

Što je PCR (lančana reakcija polimeraze)?

Lančana reakcija polimeraze (PCR) tehnika je koja se koristi da bi se povećala količina DNK u tragovima (a u nekim slučajevima i RNA) koja se nalazi u ili na gotovo bilo kojoj tekućini ili površini na kojoj se mogu odložiti lanci DNA. Ključno za razumijevanje PCR-a jest znati da svaki čovjek, životinja, biljka, parazit, bakterija ili virus sadrži genetski materijal poput DNK (ili RNA) sekvenci (nukleotidne sekvence ili komadići DNK ili RNK) koji su jedinstveni za njihove vrste, i do pojedinog člana te vrste. Prema tome, ako uzorak sadrži segmente DNK ili RNK, PCR je metoda koja se koristi za amplifikaciju (stvaranje mnogo više identičnih kopija) ovih jedinstvenih sekvenci, tako da se oni mogu koristiti za utvrđivanje s vrlo velikom vjerojatnošću identiteta izvora (a određene osobe, životinje ili patogeni organizam) DNK ili RNA u tragovima koji se nalaze u ili na gotovo bilo kojem uzorku materijala.

Međutim, PCR pojačavanje samo je dio identificirajućeg testa. Nakon što je amplifikacija izvršena (vidi dolje), pojačane segmente treba usporediti s drugim nukleotidnim segmentima iz poznatog izvora (na primjer, specifična osoba, životinja ili patogeni organizam). Ova usporedba jedinstvenih segmenata često se provodi postavljanjem nukleotidnih sekvencija koje generiraju PCR pored poznatih nukleotidnih sekvenci ljudi, patogena ili drugih izvora u gelu za razdvajanje. Električna struja prolazi kroz gel, a različiti nukleotidni nizovi tvore trake koje prema svom električnom naboju i molekularnoj veličini nalikuju "ljestvici". To se naziva elektroforeza gela. Trake ili "ljestve" poput koraka koji migriraju na iste razine u gelu pokazuju identitet nukleotidnih nizova. Ova je metoda jedan od najpopularnijih načina na koji se PCR testovi dovršavaju (vidi Sliku 1).

Slika 1, trake ili "ljestve" poput koraka PCR-a proizvele su DNA mikobakterija (ljubaznošću CDC-a)

Lik. Ponavljajući elementi (Rep) –PCR (A) i gel elektroforeza s pulsirajućim poljem (PFGE) (B) uzorka izolata Mycobacterium cosmeticum dva pacijenta u Ohiu i jednog pacijenta u Venezueli. Rep-PCR je proveden korištenjem BOXA1R primera (3), a PFGE je proveden s restrikcijskim enzimom AseI. Staze 1, 2, Ohio izolira OH1 i OH2; trake 3, 4, kontrolni sojevi ATCC BAA-878T i ATCC BAA-879; traka 5, venecuelanski izolat VZ1. Standardi veličine DNK su 100-bp (S1) i 48, 5-kb marker (S2).

Kako se provodi PCR (lančana reakcija polimeraze)?

Kary Mullis je 1983. godine smislio osnovne korake za pojačavanje sljedova DNK. On i Michael Smith dobili su Nobelovu nagradu za razvoj ovog postupka 1993. Nekoliko je osnovnih koraka koji se slijede uzastopno; PCR se može raditi u jednoj cijevi s odgovarajućim kemikalijama i posebno dizajniranim grijačem. Potrebni reagensi ili kemikalije su sljedeći:

• Uzorak koji sadrži nukleotidnu sekvencu (od krvi, dlaka, gnoja, struganja kože itd.)
• DNA primera: kratka jednolančana DNA koja se veže za nukleotidne sekvence koja promiče sintezu komplementarnog lanca nukleotida
• DNK polimeraza: enzim koji, kada se na DNK veže za temeljni premaz, silazi niz DNK segment vežući DNK gradivne blokove kako bi formirao komplementarne bazne parove i tako sintetizira komplementarni nukleotidni lanac DNK (uvođenje DNK polimeraze otporne na toplinu, Taq polimeraza, dobivena iz bakterija otpornih na toplinu, značajno je poboljšala sposobnost provođenja PCR-a)
• Veliki višak građevnih blokova DNA nazvan je nukleotidima (Adenin, Timidin, Citozin i Guanin, skraćeno: A, T, C, i G, respektivno). Kad se ovi blokovi povežu zajedno, tvore nukleotidnu sekvencu ili jedan niz DNA. Kad ti građevni blokovi vežu svoj komplementarni građevni blok slabim vodikovim vezama (na primjer, A će se vezati samo s T, a G samo sa C), komplementarni niz nukleotida DNA nastaje i veže se s izvornom jednolančanom DNK. Kad je vezanje završeno, nastaje komplementarna DNA s dvostrukim lancem u specifičnom slijedu.

PCR tada započinje segmentom DNA iz uzorka koji je smješten u epruvetu s gore navedenim reagensima. Otopina je zagrijana na najmanje 94 ° C (201, 2 F); ta toplina razbija vodikove veze koje omogućuju formiranje komplementarnih lanaca DNA, tako da u smjesi postoje samo pojedinačni lanci (to se naziva denaturacijom dvolančane DNK).

Smjesa se ostavi da se ohladi na oko 54 ° C (129, 2 F). Na toj se temperaturi primeri DNA i polimeraza DNA vežu na pojedinačne jednolančane DNK (to se naziva žarenje DNK). Budući da su građevinski blokovi u višku (visoka koncentracija), polimeraza ih koristi za stvaranje novih komplementarnih lanaca DNA (nazvanih produženjem DNK), a taj je postupak brži pri 72 ° C (161, 6 F). Tim se postupkom stvara nova dvolančana molekula DNA iz svake pojedinačne žice izvorne molekule.

Ovaj se ciklus ponavlja oko 40 puta u stroju nazvanom termički ciklus koji automatski ponavlja ciklus grijanja-hlađenja, s tim da se količina svakog DNK sekvence udvostručuje svaki put kada je ciklus grijanja-hlađenja završen. Ono što je u početku bio jedan kratki segment DNK, može se povećati na oko 100 milijardi primjeraka nakon 40 dvostrukih ciklusa.

Zašto bi liječnik naredio test PCR (lančana reakcija polimeraza)?

PCR test čini osnovu niza testova koji mogu odgovoriti na mnoga različita medicinska pitanja koja pomažu liječnicima da dijagnosticiraju i liječe pacijente. Na primjer, PCR testovi mogu otkriti i identificirati patogene organizme u pacijenata, posebno one koje je teško kultivirati (na primjer, HIV i druge viruse i određene gljivice).

Drugi liječnici naručuju PCR testove kako bi pomogli dijagnosticirati genetske bolesti, dok drugi liječnici koriste PCR za otkrivanje bioloških odnosa poput identificiranja roditelja djece. PCR testovi također se koriste za prepoznavanje i karakterizaciju genetskih mutacija i preuređenja pronađenih u određenim vrstama karcinoma.

Međutim, PCR testovi su izmijenjeni i prošireni u mnoge aspekte znanstvenih istraživanja, uključujući evolucijsku biologiju, genetski otisak prstiju, forenzička ispitivanja i mnoge druge.

Što je RT-PCR?

RT-PCR je PCR test koji je osmišljen za otkrivanje i mjerenje RNA. Iako su početni PCR testovi pojačali DNK, mnogi virusi i druge biološke komponente (na primjer, mitohondrije) koriste RNA kao svoj genetski materijal. RT-PCR se razlikuje od konvencionalnog PCR-a po tome što prvo uzima RNA i pretvara RNA lanac u DNA lanac. To se provodi u osnovi istom metodom za PCR gore opisanom, s izuzetkom korištenja enzima nazvanog reverzna transkriptaza umjesto DNA polimeraze. Obrnuta transkriptaza omogućava da se jedan lanac RNA pretvori u komplementarni lanac DNA. Jednom kada se dogodi ta reakcija, rutinska PCR metoda može se tada koristiti za amplifikaciju DNA. RT-PCR se koristi za otkrivanje i proučavanje mnogih RNA virusa.

RT-PCR ne treba miješati s drugom varijacijom PCR-a, nazvanom PCR u stvarnom vremenu. Real-time PCR je varijacija PCR-a koja omogućava analizu pojačane DNK tijekom uobičajenih 40 ciklusa postupka. Iako je postupak sličan uobičajenom PCR-u s biciklizmom, u stvarnom vremenu PCR koristi fluorescentne boje pričvršćene na neke od građevnih blokova ili malih nukleotidnih lanaca. Ovisno o primijenjenoj metodi, fluorescencija nastaje kada se formiraju pojačani lanci DNA. Količina fluorescencije može se mjeriti tijekom 40 ciklusa i omogućuje istraživačima da mjere specifične proizvode i njihove količine tijekom ciklusa amplifikacije. To često omogućava istražiteljima ili laboratorijskim tehničarima da preskoče gel elektroforezu ili druge sekundarne postupke potrebne za analizu PCR proizvoda, stvarajući tako brže rezultate.

Real-time PCR i RT-PCR su varijacije ili modifikacije izvornog PCR testa. Međutim, postoji mnogo više varijacija (najmanje 25) koje postoje i koriste se za rješavanje specifičnih problema. Svi oni imaju različita imena kao što su Assembly PCR, PCR s vrućim pokretanjem, Multiplex PCR, Solid-Phase PCR i mnogi drugi.

PCR će se vjerojatno nastaviti mijenjati kako bi pomogao odgovoriti na bilo koja druga pitanja iz medicine, biologije. i drugim poljima studija.